戴斯蒙德 迈尔斯因为被朱诺控制后记忆混乱，肖恩和瑞贝卡只能将他重新放入Animus中，让他的自主意识到达Animus的中枢，继续拼接记忆碎片，读取关于艾吉奥和阿泰尔的记忆。

人类历史迈入了16世纪，主人公艾吉奥奥迪托雷也年过半百，不过他的探索还没有结束。

1511年年初，冒着冬天的严寒，Ezio来到了曾经作为刺客总部的中东小镇马西亚夫，寻找祖先阿泰尔留给后代的信息。在他即将踏入刺客城堡的大门时，被一群手执兵器的士兵包围。他们是已经覆灭的拜占庭帝国残存的一支圣殿骑士，现在他们又渐渐发展壮大。Ezio被抓住，但很快便伺机逃脱。在试图离开城堡时他通过一名被圣殿骑士绑架来的人得知了圣殿骑士的阴谋——他们在寻找5把马西亚夫之钥，来打开刺客城堡中的密室。

循着此人的线索，Ezio杀死了正在逃亡的骑士队长，从他身上搜得一本带有线索的日记，为此在1511年5月，Ezio根据乘船来到了欧亚的交汇处——奥斯曼帝国控制下的君士坦丁堡（土耳其人称为伊斯坦布尔），他发现圣殿骑士在前拜占庭帝王后代“君士坦丁十一世”的领导下，迫害君士坦丁堡人民，为奥斯曼王室平民所忌恨。

在刺客大师约瑟夫·塔奇姆和刚刚认识的博学女孩索菲亚萨托的帮助下，Ezio逐渐在城中安家落户，并抓紧时间与圣殿骑士赛跑寻找马西亚夫之钥。Ezio还答应了奥斯曼帝国王子，因权力之争丧父的苏莱曼王子（Suleiman，后来的苏莱曼大帝），帮助他调查圣殿骑士的指挥官是何人和大本营所在。

在苏莱曼的请求下，艾吉奥刺杀了疑似圣殿骑士的近卫队长，但他发现近卫队长竟一直与圣殿骑士斗争，并在临死之时交给艾吉奥一封信。艾吉奥便突破了金角湾的封锁乘船离开了君士坦丁堡。当艾吉奥来到圣殿骑士的老巢——卡帕多奇亚后，找到了近卫队长塔里克派来的卧底，并引爆了圣殿骑士的军火库杀死了君士坦丁十一世。当离开时艾吉奥才发现真正的圣殿骑士领导人是苏莱曼的叔叔艾哈迈德，他威胁艾吉奥交出马西亚夫之钥，否则他会杀死索菲亚。

艾吉奥回到了君士坦丁堡，但等待他的是约瑟夫早已冰冷的尸体和一片狼藉的索菲亚书店，他拿来了马西亚夫之钥，并救出索菲亚后，与索菲亚一起追赶艾哈迈德并杀死了他夺回了钥匙。但艾吉奥也受到了当时苏丹的驱逐。

艾吉奥与索菲亚一同来到马西亚夫城堡打开了阿泰尔图书馆的大门，他发现了空无一物的书架和阿泰尔的尸体以及阿泰尔的最后一片记忆和他的“金苹果”。艾吉奥在阿泰尔图书馆中褪下了他的袖剑最终告别了他数十年的刺客生涯。

而在Animus机器也找到了戴斯蒙和第十六号试验对象的意识，在Animus岛重组开始的一瞬间第十六号试验对象将戴斯蒙重新推进记忆当中救了戴斯蒙一命。而戴斯蒙的意识逐渐清晰，脑活动越来越频繁并在Animus看到了第一文明人对他的告诫并让他寻找大神庙，挽救人类的生命。而戴斯蒙最终从Animus中醒来。